自從紐約戰役後，史蒂芬‧羅傑斯定居華府，花費兩年時間適應現代環境、苦讀錯過的世界歷史，一日協同著娜塔莎‧羅曼諾夫以及布洛克‧朗姆洛率領的神盾局反恐打擊小組，到一艘被法裔海盜喬治‧巴曹克挾持的衛星船「雷姆利亞星號」解救人質，但娜塔莎卻私自脫隊來到控制台上複製資料。史蒂芬為此不滿來到三飛飾總部上報尼克‧福瑞局長，福瑞便帶他參觀世界安理會即將完工的「洞見計畫」（Project Insight）：通過三架新造的次世代空中航母上裝載的武器，鎖定世界上所有威脅並取得先機。即使如此，史蒂芬還是看不上這種維護正義的方式。

無法讀取船上獲取的資料後，福瑞漸漸對神盾局內部感到不安，希望高級主管亞歷山大‧皮爾斯暫緩計畫實行。福瑞離開基地的路上，遭遇一群假冒警隊和其領隊「酷寒戰士」伏擊，僥倖逃生的他立即趕去通知史蒂芬，但酷寒戰士馬上趕來重傷福瑞，使他搶救不及而喪生。史蒂芬從福瑞手上得到裝載資料的隨身碟，將其藏好後回總部匯報，遵從福瑞生前的「不要相信任何人」之命令。然而不久，朗姆洛帶領眾神盾局特工突然合夥打算抓捕他，史蒂芬逃離總部回到醫院取回隨身碟，而娜塔莎稱酷寒戰士過去五十年來犯下過數十起重大刺殺案。無人可信之下，兩人追蹤隨身碟信號來源地：新澤西州的棄置美軍基地，也是史蒂芬二戰時的舊訓練營。他們於基地地下室找到一個龐大電腦資料庫，當中的人工智慧本尊為阿尼姆‧索拉，於1972年因絕症逝世前將思想保存在這裡。

索拉供述他二戰時被俘虜後，被剛建立的神盾局招募進去作為戰略顧問，讓他秘密在神盾局內部重塑九頭蛇。組織隨著七十年的和平一年一年壯大，一向透過酷寒戰士暗殺來清除障礙，還透漏洞見計畫是九頭蛇崛起的關鍵。這時，神盾局的導彈飛來摧毀整座地下室，兩人再度僥倖逃生，史蒂芬去找他晨練時結識的美軍退伍傘兵山姆‧威爾森求助，而山姆決定靠一副機械滑翔翼協助他們。三人抓獲九頭蛇間諜賈斯伯‧西德維爾拷問，得知洞見計畫將以索拉生前寫出的演算法來找出所有「未來可能會阻礙九頭蛇」的目標人物，最後由最新航母的武器將目標全數殲滅。

史蒂芬等人決定孤軍奮戰，開車前往總部時受酷寒戰士伏擊，說出九頭蛇機密的賈斯伯先被殺，娜塔莎也中槍受傷。史蒂芬在激烈格鬥下將戰士的面罩取下，卻發現他的真面目是二戰時陣亡的摯友巴奇‧巴恩斯。史蒂芬發現巴奇毫無記憶，而朗姆洛帶隊到場後將他們抓捕，但所幸臥底在隊中的瑪莉亞‧希爾將他們救離，帶往藏身處後與倖存的福瑞會合，其利用布魯斯‧班納的醫學技術呈現假死。福瑞提供三張能夠阻止所有母艦的病毒磁片，同時認同必須犧牲神盾局才能徹底擊潰九頭蛇。隔天，史蒂芬換回二戰時戰服後帶隊潛入三飛飾總部，用廣播對總部中所有人員公開實情。

總部內隨即爆發內戰，所有九頭蛇成員露出真面目並開始行動，以雪倫‧卡特為首的神盾局特工開始抗擊九頭蛇陣營，但三架母艦還是被手動升空。眾安理會議員發現皮爾斯的真面目後都遭到挾持，但偽裝在內的娜塔莎突然現身解救、伴隨著坐直升機到場的福瑞，開始將神盾局和九頭蛇的所有機密文件全部公諸於世。但皮爾斯靠所有議員身上的徽章炸彈殺死其他議員後，一度靠挾持娜塔莎而重奪控制權。安裝完一號與二號艦的磁片後，史蒂芬獨自和看守最後母艦的巴奇進行一番苦鬥，在母艦即將擊殺目標之際安裝完最後磁片。希爾改寫系統而讓三架母艦相互開炮，全部慢慢自我解體下墜，發現前功盡棄的皮爾斯本想靠挾持娜塔莎來逃跑，但福瑞找準時機射殺他。兩架艦艇墜入河中，其中一架撞毀總部大樓，讓朗姆洛直接陷進瓦礫堆中，山姆破窗跳進福瑞的直升機中獲救。

史蒂芬面對巴奇無法痛下殺手，而艦艇平台的塌陷讓他墜入河中，但巴奇因史蒂芬所講的「我會一直陪你到最後」而產生影響，於是跳進河裡將他救上岸後離開現場。史蒂芬送醫後日漸康復，神盾局事後正式解體，大部分成員均刪除個人資料後各奔東西。公開的九頭蛇資料使所有與組織勾結的政府官員都被逮捕，而劫後餘生的朗姆洛從大樓殘骸中挖出來後被送去搶救。福瑞決定隱瞞他還活著的事實，將他的資料與獨眼罩倒油放火燒盡後，便前往歐洲去調查九頭蛇的餘黨。娜塔莎感謝史蒂芬的救命恩情，為他提供酷寒戰士的文件後，史蒂芬決定與隨行的山姆合作去尋找他。

在九頭蛇位於歐洲「蘇科維亞」的基地裡，沃夫岡‧馮‧史特拉克得知組織信息被公諸於世的事情後，開始收拾殘局工作的同時，也開始著手他掌有的「兩個奇蹟」：神盾局所回收的齊塔瑞權杖、以及一對擁有異能力的「雙胞胎兄妹」。巴奇受史蒂芬對他講述的身世所影響，於是來到美國隊長紀念館觀摩自己二戰時的資料來慢慢恢復記憶。